همسانه سازی ژن فعال کننده پلاسمینوژن بافتی نوترکیب (tpa) انسانی و انتقال آن به کلروپلاست توتون با استفاده از روش بمباران ذره ای

گیاهان یک جایگزین مناسب برای سیستم های معمول بیان پروتئین های نوترکیب، نظیر حیوانات یا سیستم های میکروبی می باشند. در زراعت مولکولی علاوه بر بیان موقت ژن (های) هدف می توان آنها را به هسته یا کلروپلاست سلول گیاهی منتقل کرد. به دلیل پلی پلوئیدی ژنوم پلاستیدهای گیاهی، در صورت تراریختی کلروپلاست، هزاران کپی از ژن هدف در هر سلول وارد و حجم بسیار بالایی از پروتئین نوترکیب در این اندامک ها تولید می شود. بیماری های قلبی- عروقی سومین عامل مرگ و میر انسانی هستند. پروتئین انسانی tpa (tissue plasminogen activator) یکی از مهم ترین پروتئین های نوترکیب داروئی است که به منظور از بین بردن لخته خون در بخش های مختلف بدن از جمله رگ های خون رسان به قلب و مغز استفاده می شود. فرم اصلاح شده پلاسمینوژن بافتی (k2s) دارای نیمه عمر پلاسمایی طولانی تر، قدرت نفوذ در لخته و فعالیت تجزیه فیبرین بالاتر می باشد. در این پروژه تحقیقاتی، به منظور انتقال ژن k2s به کلروپلاست گیاه توتون،cdna مربوطه پس از تکثیر به کمک pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، در ناقل t/ptz57r درج و همسانه سازی شد. پس از اطمینان از صحت چارچوب بازخوانی ژن از طریق توالی یابی، قطعه هدف در ناقل کلروپلاستی pkcz خاص گیاه توتون درج و در باکتری e. coli سویه dh5? همسانه سازی شد. جهت تسهیل تخلیص محصول پروتئین تولیدی از طریق کروماتوگرافی، توالی شش هیستیدین و توالی پروتئازی فاکتور xa به انتهای آمینی ژن k2s الحاق شد. ناقل حامل ژن هدف با استفاده از روش زیست پرتابی، به ریزنمونه های برگی شلیک شد. سپس ریزنمونه های دریافت کننده ژن به منظور انتخاب سلول های تراریخته بر روی محیط گزینش گر حاوی 500 میلی گرم در لیتر آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین قرار گرفتند. پس از باززایی جوانه های تراریخته، به منظور رسیدن به هموپلاسمی، زیرکشت های متعدد و حداقل سه دوره باززایی نوساقه در حضور آنتی بیوتیک گزینش گر انجام شد. حضور و تلفیق تراژن k2s در گیاهان ترانس پلاستومیک با آنالیز pcr و هموپلاسمی به کمک کاوشگرهای طراحی شده و آزمون دورگه سازی به روش سادرن به تایید رسید. ارزیابی بیان ژن هدفk2s و میزان پروتئین تولیدی با آنالیز rt-pcr، sds-page، لکه گذاری نقطه ای، وسترن بلات و الایزا انجام شد. فعال بودن پروتئین تولید شده در گیاهان تراریخته با آزمون زیموگرام تایید شد. پروتئین tpa تولیدی در گیاهان ترانس پلاستومیک توتون، با ستون نیکل و روش کروماتوگرافی میل ترکیبی به فلز، تخلیص شد. حضور پروتئین tpa (فرم k2s) در نمونه های حاصل تخلیص پس از وسترن بلات، مورد تایید قرار گرفت. نتایج این تحقیق نشان داد که میزان پروتئین tpaتولید شده در کلروپلاست به طور قابل ملاحظه ای نسبت به گزارشات قبلی بیان پروتئین tpaدر هسته گیاه افزایش داشته است و اندامک کلروپلاست به عنوان یک بیوراکتور طبیعی از پتانسیل خوبی جهت بیان tpa برخوردار است.